65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 6. Farmacologia - 4. Farmacologia

Estudo do mecanismo de morte celular induzido pelo M8A (N-pentil-nitrofurantoina) em células HL-60

Jeyce Kelle Ferreira de Andrade - Departamento de Antibióticos - UFPE Sandra Cabral da Silva - Departamento de Antibióticos - UFPE Paulo Bruno Roberto da Silva - Departamento de Fisiologia e Farmacologia - UFPE Gardênia Carmem Gadelha Militão - Departamento de Fisiologia e Farmacologia - UFPE Manoel Adrião Gomes Filho - Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal - UFRPE Teresinha Gonçalves da Silva - Prfa. Dra./Orientadora - Departamento de Antibióticos - UFPE

INTRODUÇÃO:

O câncer é um conjunto complexo de doenças genéticas distintas, unidas por características comuns, como potencial proliferativo ilimitado, autossuficiência nos sinais de crescimento e resistência aos sinais antiproliferativos e apoptóticos (LUO, SOLIMINI, ELLEDGE, 2009). O combate ao câncer envolve a descoberta dos processos bioquímicos que levam a célula a se modificar e se tornar neoplásica, assim como as formas de induzir esta célula a sofrer morte celular. O processo de morte celular tem um papel fundamental no tratamento de várias doenças, pois é através da modulação das vias de morte que vários fármacos promissores estão sendo desenvolvidos. O uso de antibióticos na quimioterapia ainda é muito restrito, esses produtos resultaram da triagem de produtos antimicrobianos que levam a inibição do crescimento celular, por isso se mostram úteis no tratamento do câncer (INCA, 2012). A nitrofurantoína é um derivado nitrofurano hindantoínico amplamente utilizado no tratamento de infecções do trato urinário e bacteriúria assintomática, contudo, surgiu a necessidade do melhoramento do desempenho da atividade biológica desta classe de compostos através da introdução de novos substituintes, tendo como "scaffold" a nitrofurantoína. O derivado escolhido para o presente trabalho foi o M8A ( N-pentil-nitrofurantoína) obtido através de modificações moleculares por n-alquilação da nitrofurantoína.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Analisar o possível mecanismo de morte celular e bloqueio do ciclo celular induzidos de um novo derivado da Nitrofurantoína através da análise morfológica (Anexina V) e da análise de fragmentação do DNA (DNA Ladder).

MÉTODOS:

Para verificar se as células da linhagem Hl-60 ( Leucemia Promielocítica aguda), estavam sofrendo processo de apoptose induzidas pelo composto M8A ( N-pentil-nitrofurantoina), foi realizado utilizando a Anexina V/iodeto de propídeo. As células da linhagem HL60 foram distribuídas em placas de 24 poços na concentração de 0,3x106 células/mL e incubadas com o composto M8A (6,0 e 12,0 µM). A doxorrubicina (3,0 µM) foi utilizada como controle positivo e o controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) utilizado para dissolver as substâncias, 0,1%. As amostras foram analisadas em microscópio de fluorescência. Para verificar a ocorrência de diferenças significativas entre os grupos, os dados foram comparados através da análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Newman-Keuls, com nível de significância de 5% (p< 0,05). No teste do DNA ladder a extração do DNA foi realizada através do protocolo fenol-Clorofórmio-Alcoól isoamílico. Os padrões de banda foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2% corado com Blue green loading dye I (LGC- Biotecnologia).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Os resultados mostram que o M8A nas doses de 6,0 e 12,0 µg/mL induziu apoptose em 49 e 60% das células, e causou necrose em 10% e 15% das células, respectivamente. A análise por microscopia de fluorencência permitiu verificar que algumas células possuíam apenas a externalização da fosfatidilserina, enquanto outras apresentavam, além da externalização da fosfatidilserina, o núcleo marcado com o iodeto de propídeo. Isto se dá ao fato de que o processo de apoptose na sua fase inicial apresenta membrana plasmática íntegra, o que não permite a entrada do iodeto de propídeo, portanto a célula fica toda marcada de verde fluorescente. No entanto na fase final da apoptose há uma perda da integridade da membrana o que permite a entrada do iodeto de propídeo, marcando o núcleo de vermelho, o que é considerada uma apoptose tardia (BRATON et. al, 1997). No teste do DNA ladder o composto M8A na concentração de 12,0µg/mL causou fragmentação do DNA no padrão de escada, o que não ocorreria caso a morte celular fosse por necrose. Uma das principais características da apoptose é o processo de fragmentação do DNA em fragmentos com 180-200 pares de base ou múltiplo integrais, produzindo o típico "Padrão em escada” no gel (GOLD et al, 1993). O teste do DNA ladder confirmou os resultados da microscopia de fluorescência mostrando assim que o composto M8A está induzindo a morte celular por apoptose.

CONCLUSÕES:

Os testes de mecanismo de ação mostraram que o composto M8A induz as células de HL-60 a sofrerem processo de morte celular por apoptose. BRATTON, D.L.; FADOK, V.A.; RICHTER, D.A.; KAILEY, J.M.; GUTHRIE, L.A.; HENSON, P.M. Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires calciummediated nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the aminophospholipid translocase. J. Biol. Chem. v. 272: 26159-26165. 1997. GOLD, R.; SCHMIED, M.; ROTHE, G.; ZISCHLER, H.; BREITSCHOPF, H.; WEKERLE, H.; LASSMANN, H. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry . v.41 (7): 1023–1030. 1993. INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (INCA). Quimioterapia. Disponível em: http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?ID=101 Acesso em: 27 de Nov de 2012. LUO, J.; SOLIMINI, N.L.; ELLEDGE, S.J. Principles of Cancer Therapy: Oncogene and Non-oncogene Addiction. Cell. V. 136(5): 823–837. 2009.

Palavras-chave: Câncer, Nitrofurantoína, Apoptose.