65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 5. Química de Macromoléculas

PURIFICAÇÃO PARCIAL DE LECTINA(S) DA FOLHA DE Cinnamomum verum Presl

Priscila Marcelino dos Santos Silva - Departamento de Bioquímica - UFPE Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho - Departamento de Bioquímica - UFPE Tatiana Souza Porto - Departamento de Bioquímica - UAG- UFPE Maria Tereza dos Santos Correia - Profa. Dra./Orientadora - Departamento de Bioquímica - UFPE

INTRODUÇÃO:

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que reconhecem específica e reversivelmente carboidratos e glicoconjugados através de sítios de ligação. São encontradas em vírus, microrganismos, vegetais e animais. Apresentam ampla aplicabilidade em pesquisa médica, biológica e bioquímica. O primeiro passo para conseguir uma preparação pura de lectina é a obtenção do extrato bruto. O planejamento fatorial de experimentos visa um processo extrativo mais efetivo e possibilita o conhecimento das interações entre as variáveis que interferem na extração, reduzindo a quantidade de ensaios e gastos. As lectinas são purificadas através de métodos cromatográficos, como exclusão molecular, afinidade ou troca iônica.Os métodos eletroforéticos são utilizados na caracterização, avaliando pureza e massa molecular. Cinnamomum verum Presl é uma planta pertencente à família Lauraceae, conhecida como canela-da-índia e utilizada na medicina popular como adstringente, afrodisíaca, antiescorbútica, antirreumática, antiséptica, cardiotônica, carminativa e abortiva. A presença de lectina foi detectada em extratos de folha de Cinnamomum verum com alta atividade hemaglutinante, demonstrando o potencial desta planta como fonte para obtenção de lectinas.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Estabelecer as melhores condições de extração de lectina(s) da folha de Cinnamomum verum Presl utilizando o Planejamento fatorial completo 24, purificar a(s) lectina(s) por fracionamento salino com sulfato de amônio seguido de métodos cromatográficos e avaliar através de eletroforese SDS-PAGE o padrão de pureza da(s) lectina(s) obtida(s).

MÉTODOS:

As folhas foram secas e trituradas. As extrações foram baseadas no Planejamento fatorial completo 24, sendo 16 extrações e 4 repetições no ponto central, utilizando as variáveis temperatura, tempo, pH e concentração de NaCl. As interações entre as variáveis foram analisadas pelo software Statistica 8. A Atividade hemaglutinante (AH), a dosagem protéica e a Atividade hemaglutinante específica (AHE) foram determinadas para definir as melhores condições de extração. O extrato com maior AHE foi submetido a um estudo de influência do pH, variando de 3,0 a 10,0 e após determinar a melhor faixa de pH os tampões Citrato fosfato e fosfato de sódio foram escolhidos para avaliar o extrato mais eficiente. O extrato selecionado foi submetido a fracionamentos com sulfato de amônio, e as frações obtidas dialisadas. O ensaio de inibição da AH foi realizada utilizando carboidratos e glicoproteínas para avaliar a especificidade lectínica. A fração com maior AHE foi submetida a cromatografia de afinidade em Quitina. Eletroforese SDS-PAGE sob condições desnaturantes e redutoras foi realizada e as proteínas detectadas com solução de azul Brilhante de Coomassie G-250. Os dados estatísticos foram analisados através do Sistema de Análises Estatísticas (SAS) do Excel/Microsoft.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Para a extração de lectina(s) da folha de C. verum, o pH 6,0, NaCl 0,15 M, 16 horas e 4 °C foram as melhores condições, pois possibilitaram maior AHE (6237,96) ao extrato, sendo mais eficiente para preservar e manter a atividade lectínica. A variável mais significativa foi o tempo e a interação pH x tempo mais influente. O estudo de influência do pH confirmou o pH 6,0 como melhor para atividade lectínica. A extração com tampão fosfato de sódio, 10 mM, pH 6,0 aumentou a AHE (13.353,3), sendo a condição selecionada. Nos testes de inibição da AH, nenhum monossacarídeo inibiu a AH lectínica, mesmo na maior concentração testada. Entretanto, as glicoproteínas caseína, ovoalbumina, asialofetuína, tiroglobulina, soro fetal bovino e fetuína inibiram a AH. Do extrato foram obtidas as frações F0-60%, FS60%, F0-20%, F20-40%, F40-60%, F60-80% e FS80%. F0-60% apresentou maior AHE (1.125,7) e rendimento (64%), sendo selecionada para purificação cromatográfica. Na cromatografia em Quitina, observou-se AH= 16 nas frações adsorvidas eluídas com ácido acético. No gel SDS-PAGE do extrato, fração e material adsorvido mostrou duas bandas constantes e idênticas com peso molecular aproximado de 66,000 Da, sugerindo duas subunidades ou proteínas diferentes.

CONCLUSÕES:

O Planejamento fatorial completo 24 contribuiu na definição das melhores condições de extração de lectinas de folhas de Cinnamomum verum, tornando essa etapa mais rentável e eficiente na otimização da atividade lectínica, sendo essas condições a presença de tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 6,0, contendo NaCl 0,15 M, por 16 horas a 4 °C. A precipitação salina foi uma etapa fundamental, uma vez que a fração F0-60% concentrou as lectinas presentes no extrato e apresentou maior atividade, sendo escolhida para purificação. A(s) lectina(s) presente(s) no extrato não são específicas para os carboidratos testados, mas são parcialmente inibidas pelas glicoproteínas testadas. Foi possível evidenciar a presença de lectinas nas frações adsorvidas da cromatografia pela detecção da atividade hemaglutinante, porém não significa que a lectina está pura. A realização de outras cromatografias acompanhadas de eletroforeses e ensaios mais precisos que identifiquem a presença da proteína devem ser realizados para obtenção da lectina pura.

Palavras-chave: Planejamento fatorial completo 24, Atividade hemaglutinante, Cromatografia.