65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA MELOCACTUS CONOIDEUS

Jackeline Santos Alves - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais, UESB, Itapetinga / BA Ana Paula Oliveira Pires - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais, UESB Bianca Oliveira dos Santos Viana - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais, UESB Carlos Bernard Moreno Cerqueira-Silva - Prof. - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB. Elisa Susilene Lisboa dos Santos - Profa. / Orientadora - Depto de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB.

INTRODUÇÃO:

O gênero Melocactus abrange espécies que apresentam um alto grau de endemismo, associado a um risco de extinção, e portanto, necessita de inúmeras ações de pesquisa que possam contribuir direta e indiretamente para conservação de suas espécies. Dentre estas espécies que encontram-se criticamente ameaçadas de extinção, tem-se o Melocactus conoideus, cuja ocorrência é restrita à Serra do Periperi no município de Vitória da Conquista BA. Pesquisas realizadas têm apontado a ação antrópica como importante fator que contribui para a ameaça de extinção da espécie, tendo-se a perspectiva de redução crescente na área natural de ocorrência da espécie. Neste contexto, fica evidente a necessidade de ações de pesquisa que visem, ainda que indiretamente, contribuir para conservação do M. conoideus. Os marcadores moleculares constituem ferramentas úteis aos estudos genéticos, uma vez que permitem acessar variações em sequências de DNA e assim detectar os polimorfismos entre indivíduos. Entre os marcadores moleculares estão o Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) que tem auxiliado em estudos moleculares de diversos organismos contribuindo de forma significativa para elucidação de suas bases genéticas.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Estabelecer protocolo de extração de DNA para M. conoideus, e realizar testes de amplificação fazendo uso de marcadores ISSR.

MÉTODOS:

Para a otimização de protocolos de extração de DNA foram coletados frutos de M. conoideus, na Reserva Ambiental do M. conoideus localizada em Vitória da Conquista, Bahia. Estes frutos foram encaminhados ao Laboratório de Genética Molecular Aplicada da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, em Itapetinga, e submetidos a testes de extração de DNA, denominados como segue: CTAB (Doyle e Doyle, Focus, 1990), Manitol (Storchova et.al., Taxon, 2000); SDS (Moge e Bond, Mol Ecology Notes, 2003) e, Sorbitol (Russel et al., Taxon, 2010). Para cada extração foi utilizado 0,6 g de amostra de fruto, sem sementes e pendúculos, sendo estas maceradas na presença do tampão, seguindo as descrições apresentadas nos artigos que descreveram os protocolos com pequenas adaptações. Para avaliar a qualidade e quantificar os DNAs obtidos, estes foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% sendo as amostras coradas com EZ Vision (Amresco) e visualizados sob luz ultravioleta. Para testar a capacidade de amplificação dos DNAs extraídos os mesmos foram submetidos a testes de amplificação fazendo uso de primers ISSR, sendo os amplicons submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, corados com EZ Vision e visualizados sob luz ultravioleta.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Os diferentes métodos de extração de DNA avaliados (baseados no uso de CTAB, SDS, manitol e sorbitol) mostraram-se eficientes para obtenção de DNA genômico de M. conoideus. Os resultados obtidos nos protocolos Manitol, SDS e CTAB mostraram-se muito eficientes, evidenciando bandas detectáveis em gel de agarose, com alta concentração de DNA. Embora em menor quantidade, também foi observada concentração significativa de DNA com o uso do protocolo Sorbitol. Pode-se perceber que os protocolos Manitol, Sorbitol e CTAB possuem em comum o uso do detergente CTAB, que mesmo em concentrações distintas demonstrou-se relevância no resultado. Como previamente descrito na literatura, o sucesso com o uso do detergente CTAB é explicado pelo fato desse detergente solubilizar as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitação (ROMANO & BRASILEIRO, 1999). O manitol e o Sorbitol são componentes utilizados para a confecção de detergentes e, portanto, atuam solubilizando as membranas celulares. Os testes de amplificação dos DNAs obtido pelos diferentes métodos de extração utilizando iniciadores ISSR apresentaram bons padrões de amplificação, o que implica no sucesso da aplicação destes protocolos para futuros estudos moleculares em M. conoideus.

CONCLUSÕES:

Todos os quatro protocolos testados apresentaram bons resultados para a extração de DNA de M. conoideus, podendo a escolha de um destes estar associada à disponibilidade de tempo e reagentes no laboratório. As avaliações realizadas contribuem com novas e relevantes informações para a espécie em estudo, permitindo que estudos moleculares possam ser realizados.

Palavras-chave: Biologia Molecular, Cactáceas, Melocactus spp..