65ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal
COMPARAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE Melocactus conoideus E TESTE DE AMPLIFICAÇÃO DE REGIÕES GENÔMICAS USANDO MARCADORES RAPD
Ana Paula Oliveira Pires - Departamento de Estudo Básico Instrumental – UESB
Jackeline Santos Alves - Departamento de Estudo Básico Instrumental – UESB
Bianca Oliveira dos Santos Viana - Departamento de Estudo Básico Instrumental – UESB
Carlos Bernard Moreno Cerqueira-Silva - Prof.º MSc./ Departamento de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB
Elisa Susilene Lisboa dos Santos - Profa. MSc. Orientadora/ Departamento de Estudo Básico Instrumental - UESB
INTRODUÇÃO:
A família Cactaceae representada por cerca de 1.300 espécies encontra no Brasil o terceiro maior centro de diversidade, sendo 37 gêneros nativos de cactáceas, dentre estes o gênero Melocactus. O gênero Melocactus Link & Otto, conhecido popularmente como Cabeça-de-frade possui cerca de 36 espécies. Grande parte dessas espécies são encontradas na Bahia, cerca de 14 espécies, sendo 11 consideradas endêmicas e 5 delas estão altamente ameaçadas de extinção. Como exemplo, tem-se o Melocactus conoideus, espécie ameaçada de extinção e endêmica da Serra do Periperi, Vitoria da Conquista, Bahia. Durante anos essa espécie foi explorada pelo comércio ornamental, o que agravou seu estado de ameaça de extinção. Associando o potencial econômico agrega-se o risco de erosão genética da espécie. Estes fatores tornam relevante a caracterização genética dos M. conoideus, subsidiando estratégias de conservação. Considerando a inexistência de estudos moleculares relacionados à M. conoideus, a extração de DNA é de fundamental importância para futuras análises moleculares com intuito de contribuir com a preservação da espécie.
OBJETIVO DO TRABALHO:
Avaliar protocolos para extração de DNA genômico de Melocactus conoideus, bem como testar a eficiência do DNA obtido na amplificação de fragmentos genômicos via marcadores RAPD.
MÉTODOS:
A coleta foi realizada na Reserva Ambiental do M. conoideus, na Serra do Periperi (Vitória da Conquista, Ba). A extração do DNA foi realizada a partir dos frutos de M. conoideus, cuja frutificação ocorre o ano inteiro, as amostras foram envoltas em papel alumínio e conservadas a 8ºC. Os protocolos de extração de DNA testados foram previamente descritos na literatura, divergindo ente eles o tipo de tampão de extração empregado: Protocolo 1 - Manitol (STORCHOVA et al, 2000); Protocolo 2 - Sorbitol (RUSSEL et al, 2010); Protocolo 3 - SDS (MOGG e BOND, 2003) e Protocolo 4 - CTAB 5% (DOYLE e DOYLE, 2009).
A qualidade das amostras foi avaliada em gel de agarose 0,8%(m/v), mediante eletroforese e utilizando o corante intercalante EZ Vision (Amresco). As imagens da corrida eletroforética foram obtidas a partir do sistema de fotodocumentação Kodak, com incidência de Ultravioleta. Para os testes de amplificação foram utilizados primers RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 2%(m/v) em tampão de corrida TBE 1X em voltagem constante de 120 V por duas horas. A qualidade da amplificação foi visualizada com base no uso de tampão EZ Vision (Amresco) e sistema de fotodocumentação Kodak, com incidência de ultravioleta.
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Os diferentes métodos de extração de DNA avaliados (baseados no uso de CTAB, SDS, Manitol e Sorbitol) mostraram-se eficientes para obtenção de DNA genômico de M. conoideus, assim como visualizado para outras espécies vegetais.
Os resultados obtidos nos protocolos Manitol, SDS e CTAB mostraram-se muito eficazes, evidenciando bandas detectáveis em gel de agarose, com alta concentração de DNA. Embora em menor quantidade, também foi observada concentração significativa de DNA com o uso do protocolo Sorbitol. Pôde-se perceber que os protocolos Manitol, Sorbitol e CTAB possuem em comum o uso do detergente CTAB que, de acordo com o descrito na literatura, o sucesso com o uso desse detergente para diferentes espécies vegetais é explicado pelo fato desse detergente solubiliza as membranas, formando com o DNA um complexo que facilita uma posterior precipitação.
Os testes de amplificação do DNA obtido pelos diferentes métodos de extração utilizando iniciadores RAPD apresentaram bons padrões de amplificação, significando que os protocolos foram hábeis para extração de DNA genômico de boa qualidade para M. conoideus.
CONCLUSÕES:
Os diferentes protocolos testados com diferentes tampões foram eficientes na extração de DNA genômico de M. conoideus, ficando livre a escolha entre os protocolos testados, devendo observar a disponibilidade desses materiais e reagentes no laboratório. Os protocolos mostraram-se eficientes para obtenção de DNA em quantidade e qualidade adequada para procedimentos PCR. Desta forma, estes resultados são relevantes para que futuros estudos que possibilitem desvendar a base genética de M. conoideus por meio de marcadores moleculares possam ser realizados.
Palavras-chave: Biologia Molecular, Cactaceae, Cabeça-de-frade.