65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 6. Genética

OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS: METODOLOGIA COMPARATIVA ENTRE TELEOSTEI E ELASMOBRANCHII

Juliana Galvão Bezerra - Depto. Biologia Celular e Genética, LGRM - UFRN Paulo Augusto de Lima Filho - Prof. Msc - IFRN - Doutorando em Ecologia, LGRM - UFRN Karlla Danielle Jorge Amorim - Depto. Biologia Celular e Genética, LGRM - UFRN Roberta Godoy da Costa Nunes - Depto. Biologia Celular e Genética, LGRM - UFRN Wagner Franco Molina - Prof. Dr./Orientador - Depto. Biologia Celular e Genética, LGRM - UFRN

INTRODUÇÃO:

Os peixes representam o grupo de maior diversificação filética e portanto de grande interesse em estudos da variabilidade genética e evolução entre os vertebrados. Entre as abordagens evolutivas analisadas está a análise cromossômica, que tem aumentado seu poder de resolução em tempos recentes. A obtenção de cromossomos mitóticos tornou possível a implementação de procedimentos que facilitaram o entendimento das relações evolutivas estabelecidas entre as diferentes linhagens de peixes. Estudos citogenéticos em peixes evidenciam marcados exemplos de estabilidade e diversidade quanto ao número e morfologia cromossômica. Apesar dos estudos citogenéticos nos peixes terem aumentado consideravelmente, os Elasmobranchii permanecem entre os grupos menos estudados, se comparado aos peixes Teleósteos. Buscando propiciar mecanismos metodológicos apropriados para ampliação de estudos citogenéticos em peixes cartilaginosos, o presente trabalho compara a aplicabilidade do método de obtenção de cromossomos mitóticos utilizado em peixes Teleósteos, em Elasmobrânquios marinhos.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Testar a eficiência da metodologia empregada para obtenção de cromossomos mitóticos amplamente empregada para Teleósteos, nos Elasmobrânquios marinhos Dasyatis americana (Hildebrand & Schroeder 1928) e Gymnura micrura (Bloch & Scheneider 1801).

MÉTODOS:

Os Elasmobrânquios Dasyatis americana (n=4) e Gymnura micrura (n=5), provenientes do litoral do Rio Grande do Norte, foram coletados com uso de rede de arrasto. Os exemplares foram estimulados mitoticamente através da técnica preconizada por Molina et al. (2010), que faz uso de complexos de antígenos Nikkho-Vac, por 24 horas. A técnica de obtenção de cromossomos mitóticos adotada seguiu o método de preparação in vitro descrito por Gold et al. (1990). Os exemplares tiveram o rim e baço removidos, colocados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 e dissociados com seringas de vidro. O material com volume de 10 ml foi transferido para tubos falcon de 15 ml. Foi adicionada solução de colchicina 0,025% por 30 minutos, para cessar a divisão mitótica, deixando agir em temperatura ambiente. Em seguida o material foi centrifugado por 10 minutos a 900rpm. Após o excedente ser removido, acrescentou-se 9 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M), por 28 a 30 minutos em temperatura ambiente, ao término centrifugou-se por 10 minutos. A suspensão de células foi fixada em solução de metanol e ácido acético (3:1) através de três ciclos de ressuspensão e centrifugação por 10 minutos, sendo o material conservado à -20ºC em tubos de 1,5ml para análises posteriores.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

No total, foram analisadas 40 lâminas, com material das suspensões celulares. O material foi corado com Giemsa a 10% por 5 minutos e analisadas ao microscópio sob aumento de 1000X. As análises revelaram núcleos em pré-metáfase, para ambas espécies submetidas ao procedimento descrito. Este resultado indica que o emprego do método utilizado na obtenção de cromossomos mitóticos em teleósteos não é diretamente aplicável para peixes Elasmobrânquios, necessitando de adequações. É provável que o tempo de estimulação mitótica tenha sido insuficiente, bem como o tempo de exposição à colchicina, uma vez que se identificou células pré-metafásicas em baixa frequência. Assim, sugere-se que um aumento no tempo de estimulação entre 48 a 72 horas bem como uma exposição in vivo à colchicina possa produzir um número suficiente e qualitativo de células em metáfase. É provável que a dificuldade de obtenção de cromossomos mitóticos em Elasmobrânquios marinhos se deva a elevada concentração de cloreto de sódio e ureia no sangue, a partir do qual métodos hipotônicos com os tempos utilizados, podem vir a lisar a maior parte das células dos elasmobrânquios. Associado a isto, o tecido utilizado e suas características de divisão celular devem ser analisadas para obtenção de melhores índices mitóticos.

CONCLUSÕES:

A limitação na obtenção de cromossomos mitóticos nos peixes cartilaginosos impede o avanço do entendimento carioevolutivo e processos de modificação cromossômica vigorantes no grupo, visto apenas 6% das espécies vigentes possuírem dados cromossômicos, isto demonstra a extrema necessidade em se estabelecer e padronizar técnicas que proporcionem melhor eficácia na obtenção de cromossomos mitóticos. O presente trabalho, conclui que as técnicas tradicionais empregadas para obtenção de cromossomos mitóticos utilizadas para peixes Teleósteos, se usadas diretamente, são inadequadas para as espécies de elasmobrânquios marinhos estudados. Sugere-se a ampliação para 48-72h o tempo de estimulação mitótica e o uso de anti-mitótico in vivo como alternativas para aumentar a qualidade e frequência de núcleos metafásicos.

Palavras-chave: Citogenética de peixes, Raias marinhas, Método ineficaz.