65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 5. Biofísica

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR VOLTAMÉTRICO UTILIZANDO NANOTUBOS DE CARBONO E PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO PARA DETECÇÃO DE Escherichia coli

Carlos Vinícius Jackes de Oliveira - Departamento de Bioquímica/ Biomedicina – UFPE Jéssica Miranda do Nascimento - Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica – UFPE Maria Danielly Lima de Oliveira - Departamento de Bioquímica - UFPE Idjane Santana de Oliveira - Centro Acadêmico de Vitória - UFPE Octavio Luiz Franco - Centro de Análise Proteômicas e Bioquímicas de Brasília - UCB César Augusto Souza de Andrade - Prof. Dr. / Orientador - Departamento de Bioquímica - UFPE

INTRODUÇÃO:

Atualmente, o desenvolvimento de sensores utilizando nanotubos de carbono (NTC) vem se tornando uma das temáticas mais promissoras para aplicação em nanobiotecnologia, pois os mesmos podem ser funcionalizados e associados a moléculas biológicas com propriedades de reconhecimento. A clavaninaA é uma isoforma do peptídeo antimicrobiano (PAM) da família das clavaninas que tem como alvo as membranas microbianas. Podemos destacar que a sua atividade antimicrobiana é devido a sua estrutura catiônica anfipática, a qual interage via atração eletrostática com lipídios aniônicos predominantes nas membranas dos microrganismos, seguida pela penetração na membrana formando poros e levando a morte celular. Escherichia coli é uma enterobactéria gram-negativa, na qual a cepa O157:H7 é considerada um dos agentes patogênicos mais perigosos na contaminação dealimentos. Esta variante produz grandes quantidades de uma toxina potente no revestimento do intestino humano e provoca danos graves, resultando em colite hemorrágica ou síndrome urémica hemolítica, a qual pode levar à morte especialmente em crianças. A E. coli pode facilmente contaminar alimentos crus, portanto, métodos de identificação e controle desse patógeno é extremamente importante, especialmente na indústria alimentícia.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Caracterização voltamétrica do sistema NTC-PAM visando o desenvolvimento de um biossensor para a identificação de E. coli.

MÉTODOS:

A análise foi realizada por meio de voltametria cíclica (VC) com um potencial -0,2 a 0.7 V numa velocidade de varredura igual a 50mV/s-1 no equipamento µAUTOLAB (Metrohn, Holanda) em uma célula convencional contendo três eletrodos imersos em 20 mL de solução ferro-ferricianeto de potássio. Antes das medidas, o eletrodo de trabalho com superfície ouro foi polido com alumina 0,5 μM e sonicado em água deionizada por 2 minutos para limpeza. Inicialmente, o eletrodo foi imerso em tampão fosfato contendo cisteína (Cys) 10 mM por 10 minutos a temperatura ambiente para automontagem da Cys. Em seguida, o eletrodo modificado foi imerso em solução aquosa de 0.4 M de EDC (1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) e 0.1 M de NHS (N-hidroxisuccinimida) numa proporção de 1:1 (v/v) durante 10 minutos. A adição dos NTCs funcionalizados ao sistema Cys-(EDC:NHS) foi realizada pelo método dedrop-coating. Após 10 minutos da modificação com os NTCs, o eletrodo foi imerso em solução tampão contendo o PAM clavaninaA (clavA) por mais 10 minutos. O sistema Cys-(EDC:NHS)-NTC-clavA foi exposto a amostra de E. coli a 106cfu/µL através de droap-coating. Após 20 minutos, foi realizada a análise voltamétrica para avaliar eficiência do biossensor frente à amostra bacteriana.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

As análises das etapas de construção do biossensor demonstraram aumentos sucessivos da resistência elétrica correspondente à efetiva automontagem do sistema, fato evidenciado pela diminuição dos picos anódicos e catódicos do voltamograma após a adição de cada componente. A adição de Cys permitiu a ligação dos resíduos sulfidrila (-SH) do aminoácido à superfície de ouro do eletrodo, facilitando as interligações entre os demais componentes das camadas adjacentes. O EDC:NHS foi utilizado como intermediário na montagem do biossistema, pois estes elementos permitem a estabilização e interação de biomoléculas e compostos não-orgânicos. Os NTC foram funcionalizados com resíduos carboxila (-COOH) para sua efetiva interação com a clavA. Após a exposição do sistema Cys-(EDC:NHS)-NTC-clavA à amostra deE. coli foi observado uma maior redução dos picos voltamétricos, indicando que houve a ligação entre a clavA e as membranas bacterianas. Segunda a literatura, quando as bactérias são reconhecidas pelo PAM, a ligação irá ocorrer, levando a alterações nas propriedades dielétricas do sistema.

CONCLUSÕES:

De acordo com os resultados obtidos, o desenvolvimento de um biossensor composto por nanotubos de carbono e a clavA apresenta boa sensibilidade e reprodutibilidade para detecção e identificação de amostras contendo células bacterinas de E. coli. Desta forma, o sistema Cys-(EDC:NHS)-NTC-clavA pode ser utilizado na construção de um biodispositivo rápido e eficiente para detecção de agentes infeciosos de interesse clínico.

Palavras-chave: Biossensores, voltametria cíclica, bactéria.