65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

CONSTRUÇÃO E AVALIAÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO BACTERIANO PARA OS GENES E5 E E5 MULTIEPITOPOS DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO TIPO 16

Anna Jéssica Duarte Silva - Depto. Genética – UFPE Marcelo Nazário Cordeiro - Depto. Genética – UFPE Antônio Carlos de Freitas - Prof. Dr./Orientador - Depto. Genética – UFPE

INTRODUÇÃO:

O câncer cervical é o segundo mais frequente entre mulheres, e seu desenvolvimento está associado a infeccção pelo Papilomavírus Humano (HPV). O HPV tipo 16 responde por 50% a 60% dos casos de câncer cervical diagnosticados (MOTOYAMA et al., 2004). A vacinação é vista como medida de combate ao câncer cervical (DA SILVA et al., 2001). Duas vacinas profiláticas baseadas em virus-like particles estão comercialmente disponíveis, porém o alto custo dessas vacinas inviabiliza uma distribuição pela rede pública de saúde; a ineficiência contra casos onde já existe a infecção aponta para um impacto mínimo no combate ou controle do câncer cervical. Vacinas baseadas em DNA plasmidial podem representar uma estratégia ideal contra infecções por HPV tanto por prevenir novas infecções quanto por eliminar aquelas já estabelecidas (KIM et al., 2008). A oncoproteína E5 é um possível alvo para a imunização genética por estar implicada na ativação de vias de transdução envolvidas na sinalização mitogênica e proliferação celular (COFFER & KRUIJER, 1995; LEWIS et al.,1998). Para os validação de experimentos de funcionalidade in vitro da vacina de DNA é necessária a comparação com a proteína E5 de HPV-16 produzida em sistema bacteriano.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Construir plasmídeos de expressão bacteriana como parte do desenvolvimento de estratégia de imunização genética contra o câncer de colo de útero e avaliar sua funcionalidade pela detecção da expressão recombinante em células bacterianas.

MÉTODOS:

O gene sintético E5 de HPV-16 foi construído de acordo com os códons de uso mais frequentes para mamíferos (codon usage), assim como uma segunda sequência (multiepitopos de E5) contendo apenas os dois epítopos imunodominantes, em duplicata, citados na literatura. Durante sua construção, sítios de restrição XhoI e EcoRI foram adicionados para permitir sua devida inserção no vetor de expressão bacteriano pAE (HO et al. 2004). O vetor fusiona ao gene de interesse a sequência 6X HIS, o que permite a posterior detecção do produto de expressão. Cada plasmídeo resultante foi usado como agente transformante para Escherichia coli (BL21), por eletroporação (Sambrook et al 2000). A composição plasmidial desejada foi verificada através de análises de restrição, Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciamento. Uma vez selecionadas as linhagens, cada qual contendo os vetores pAE/E5H1 ou pAE/E5H2, as mesmas foram submetidas a ensaios de expressão induzida por IPTG (0,1mM). O extrato proteico total das culturas foi visualizado por SDS-PAGE, corado com Comassie, além de western blotting colorimétrico com anti-HIS conjugado a fosfatase alcalina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Através de procedimentos de clonagem molecular, as construções baseadas no vetor de expressão bacteriano (pAE) contendo os genes de interesse (E5H1 ou E5H2) foram obtidas e confirmadas, por análises de padrão de restrição e sequenciamento. Enquanto o gene E5H2 foi desenhando mantendo-se os códons nativos do gene E5-HPV-16, o gene E5H1 foi desenhado como uma sequência em duplicata dos principais epitopos imunodominantes da proteína viral E5 (Liu et al. 2007). O passo seguinte constituiu-se da avaliação da produção heteróloga da proteína de interesse. Foram realizados ensaios em menor (culturas de 1 a 2mL) e maior escala (culturas de 15mL), procurando-se estabelecer as melhores condições de indução. Inicialmente, esses ensaios foram analisados através de eletroforese em sistema desnaturante (SDS-PAGE). A proteína foi observada em gel de poliacrilamida na altura de 8 a 9 KDa . Para confirmação final, foi usada a técnica de imunodetecção por western blotting colorimétrico: a sequência 6X HIS fusionada ao vetor foi detectada pelo anti-His conjugado a fosfatase alcalina.

CONCLUSÕES:

Nossos resultados fornecem indícios de produção da proteína E5 de HPV-16 e peptídeo contendo os epitopos imunodominantes. Esses achados preliminares indicam a devida produção das proteínas recombinantes necessárias para comparação, como controles, em futuros ensaios imunológicos, para validação dos efeitos de eventuais vacinas de DNA baseadas nesses genes. O sistema bacteriano forneceu conteúdo proteico satisfatório para imunodetecção e será posteriormente otimizado para maior produção e fornecimento de proteínas purificadas.

Palavras-chave: HPV-16, Vacina DNA, CÂncer cervical.