65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

EXTRAÇÃO DE DNA E AMPLIFICAÇÃO NO GENE P21 EM AMOSTRAS DE TECIDOS CANINOS TUMORAIS E NÃO TUMORAIS PELAS TÉCNICAS DE CTAB E PCR

Elaynne Nyrocha Borges Montarroyos - Depto.de Biologia - UFRPE Igor Luiz Vieira de Lima Santos - Me, Depto.de Morfologia e Fisiologia Animal/DMFA – UFRPE Carliane Rebeca Coelho da Silva - Me, DMFA – UFRPE Diogo Manoel Farias da Silva - MV, DMFA – UFRPE Manoel Adrião Gomes Filho - Prof. Dr. - DMFA- UFRPE Áurea Wischral - Profa. Dra./Orientadora - Depto.de Medicina Veterinária – UFRPE

INTRODUÇÃO:

O tumor mamário manifesta-se como um dos tipos de carcinomas mais frequentemente encontrados em cadelas. O desenvolvimento do câncer está sobre influência de complexos sistemas controlados por genes que regulam o ciclo celular, tais como o p21, p27 e p53 entre outros, esses genes também chamados de “genes de reparo”. A ativação do gene p21 produz a proteína P21, que determina a proliferação ou diferenciação celular, ordenadamente. Uma das possíveis formas para identificação de variações nas sequências do ácido desoxirribonucleico (DNA), que alteram o produto do gene p21, é a caracterização molecular baseada na técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase). A característica básica da PCR é a capacidade de amplificar cópias de DNA a partir de pouca quantidade de material disponível. No entanto é necessário obter DNA de boa qualidade. Entre as técnicas utilizadas para extração de DNA, o brometo de cetiltrimetil amonio (CTAB), tem sido pouco utilizado em tecidos de mamíferos, mas já apresentou bons resultados em nosso laboratório na extração de DNA de células sanguíneas de ruminantes.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Avaliar a técnica de CTAB para extração de DNA de tecidos mamários caninos normais e tumorais e subsequente amplificação do fragmento do gene p21, por PCR. com primers específicos.

MÉTODOS:

Neste estudo foram coletadas e avaliadas 8 amostras de tecido normal e tumoral de mamas de cadelas, que foram mantidas à -80C. O DNA dos tecidos foi extraído usando a técnica de CTAB modificada. O tecido foi macerado manualmente e acrescentado 500 μL de CTAB. Após incubados à 65°C (30 min) foram adicionados 100 μL de CIA (clorofórmio/álcool isoamílico 24:1) e centrifugados. O tratamento com CIA foi repetido no sobrenadante. O sobrenadante obtido nesta fase foi tratado com 500 μL de isopropanol resfriado. Após incubação e centrifugação, o sobrenadante foi descartado, e ao sedimento foi adicionado1 mL de etanol 70% e posterior centrifugação. O sedimento foi seco à temperatura ambiente e o DNA final foi dissolvido em 50 μL de água ultrapura. A avaliação da qualidade do DNA foi realizada em gel de agarose a 2%. A amplificação do gene p21 foi realizada por PCR com primers desenhados especificamente para este gene. As reações tiveram um volume final de 20μl e consistiram de uma desnaturação do DNA inicial a 94°C (2 min), seguida de 35 ciclos de 94 °C (1 min), 45 ºC (1 min), 72 °C (1 min) e uma extensão final a 72 °C (5 min). Os produtos da amplificação foram analisados em gel de agarose a 2% e de acrilamida a 8%, corados com Blue Green.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

A metodologia de extração com CTAB gerou bons resultados para todas as amostras de tecidos normais e tumorais, apresentando DNA íntegro no gel de agarose. A boa qualidade do DNA também foi observada nos produtos obtidos quando o DNA foi submetido à PCR. O tampão de extração CTAB é conhecido pela sua capacidade em degradar os conteúdos celulares favorecendo a liberação efetiva dos cromossomos. Os âmplicons mostraram-se limpos e íntegros, sem observação de resto de reação abaixo dos respectivos poços de corrida. Esta eficácia na amplificação foi observada tanto no gel de agarose quanto de poliacrilamida. Para obter estes resultados satisfatórios foram realizadas várias repetições. Foi observado que nem todos os protocolos por mais acessíveis, explicativos, reproduzíveis e disponíveis que sejam, atuam de maneira única em todas as amostras de um mesmo grupo a ser analisado. Portanto, é imprescindível que os autores de tais protocolos expliquem com quais amostras trabalharam e em quais condições todo o procedimento foi realizado. Estes termos facilitarão as otimizações necessárias em cada laboratório para que os resultados aconteçam de forma mais efetiva e com menor gasto de tempo e recursos financeiros.

CONCLUSÕES:

Conclui-se que a técnica de CTAB é prática e eficiente para a extração de DNA de tecido mamário canino e que o material extraído possui qualidade suficiente para ser utilizado para amplificação de fragmentos de DNA pela PCR.

Palavras-chave: Polimorfismo, Neoplasia, Biologia Molecular.