65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 5. Biofísica

USO DA ESPECTROSCOPIA DE IMPEDÂNCIA ELÉTRICA PARA DETERMINAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DE PEPTÍDEOS MULTIFUNCIONAIS

Jéssica Miranda do Nascimento - Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica - UFPE Maria Danielly Lima de Oliveira - Departamento de Bioquímica - UFPE Octavio Luiz Franco - Centro de Análise Proteômicas e Bioquímicas de Brasília - UCB Ludovico Migliolo - Centro de Análise Proteômicas e Bioquímicas de Brasília - UCB Celso Pinto de Melo - Departamento de Física - UFPE César Augusto Souza de Andrade - Prof. Dr./ Orientador – Departamento de Bioquímica - UFPE

INTRODUÇÃO:

O uso indiscriminado de antimicrobianos tem sido um fator de risco importante para aparecimento da resistência de microorganismos, exigindo pesquisas intensas em busca de novas classes de agentes antimicrobianos. Neste sentido, vários estudos têm sido destinados aos peptídeos antimicrobianos (do inglês antimicrobial peptides – AMPs), e com menor frequência, aos peptídeos anticongelantes (do inglês antifreezing peptides – AFPs). Ambos os peptídeos têm como alvo as membranas microbianas, devido a sua estrutura, geralmente, catiônica anfipática, além de vários resíduos hidrofóbicos que possibilita a interação com as membranas dos microorganismos, seguida pela penetração na membrana formando poros e levando a morte celular. Entender os mecanismos de ação destes peptídeos é crucial para o desenvolvimento de novas moléculas eficientes, mas na prática nem sempre isto é possível devido às limitações das técnicas utilizadas. Nos últimos anos, a espectroscopia de impedância tem sido usada para desvendar os modos de ação dos AMPs, uma vez que é uma técnica robusta, sensível, que permite o estudo de uma grande variedade de AMPs em tempo real.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este trabalho tem por objetivo decifrar os possíveis mecanismos de ação do AFP análogo ao extraído do peixe antártico Pleuronectes americanus, chamado de Pa-MAP, e do AMP sintético humano LL-37 através do estudo com modelos de membranas fosfolipídicas por Espectroscopia de Impedância Elétrica (EIE).

MÉTODOS:

As medidas de impedância elétricas foram realizadas em um analisador de impedância 1260 (Solartron,UK), variando-se a frequência de 1Hz-1MHz. Foram utilizados diferentes potenciais (0V, 0.5V e 1V) e uma amplitude de 100mV. Para a determinação das partes real e imaginária da impedância foi utilizado um sistema de placas paralelas, composto por duas placas de aço inoxidável, as quais serviram como eletrodos. A formação das membranas de fosfolipídios foi feita por auto-montagem pelo método de dipping coating. O eletrodo foi imerso em uma solução de fosfolipídio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC) (1 mg.mL-1), onde foram realizadas medidas em um intervalo de tempo de 5 minutos. Após chegar ao tempo máximo da deposição (30 minutos), o eletrodo com a membrana foi transferido para um béquer contendo 5 mL da solução dos peptídeos (0.1 mg.mL-1), onde foram realizadas medidas elétricas também a cada intervalo de 5 minutos. Antes da deposição da membrana lipídica foi realizada uma medida do eletrodo sem modificações em água deionizada, a qual serviu como padrão para avaliar cada etapa de modificação. A avaliação morfológica das membranas antes e após a exposição dos peptídeos foi realizada através de microscopia eletrônica de varredura (MEV).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

A adição da camada de DPPC resultou em um aumento da resistência da transferência de carga. Com a adição de Pa-MAP e LL-37 houve uma diminuição acentuada da resistência da membrana (Rm) de aproximadamente uma ordem de grandeza devido à desestabilização da camada lipídica provocada pelos peptídeos. No entanto, a resposta do LL-37 foi inferior quando comparada com Pa-MAP. A resposta dielétrica de ambos os peptídeos foi influenciada pelo potencial aplicado, apesar de não ser muito significativo, com uma resposta superior para potenciais mais positivos. Adicionalmente, foi observado que a adição de Pa-MAP e LL-37 resultou numa diminuição drástica da Rm na no primeiro minuto de exposição, mantendo-se constante até o final do tempo de permanência (~50 minutos). Segundo Chang et al. (2008), o rompimento da membrana por peptídeos que agem pelo modelo carpete resulta em uma elevada redução ou desaparecimento completo da Rm. No entanto, a membrana pode ainda proporcionar uma barreira eletroquímica mensurável, uma vez que as regiões afetadas são reparadas por redistribuição dos lipídios e/ou peptídeos ou por difusão lateral dos lipídios a partir das regiões intactas. Nossos resultados demonstraram que ambos os peptídeos analisadas atuam pelo modelo carpete.

CONCLUSÕES:

Os resultados observados neste estudo mostram que os peptídeos Pa-MAP e LL-37 apresentam um enorme potencial para desestabilizar membranas, o que pode explicar a sua atividade antimicrobiana observada in vitro. Desta forma, os peptídeos estudados podem ser boas alternativas para o controle de microorganismos patogênicos, sendo necessários mais estudos dentro da área farmacêutica. Adicionalmente, as respostas obtidas através de EIE sugerem que estes peptídeos agem sobre as membranas através do modelo carpete. Por fim, estes resultados demonstram que a EIE é uma técnica bastante sensível que pode ser utilizada para estudos de interação peptídeo/membranas por ser capaz de detectar pequenas mudanças sobre a superfície do eletrodo.

Palavras-chave: peptídeos antimicrobianos, peptídeos anticongelantes, impedância elétrica.