65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

CARACTERIZAÇÃO DE QUITINASES COM IMPORTÂNCIA BIOTECNOLOGICA EXTRAÍDA DA LAGOSTA Panulirus argus

Juliana Gabriela Silva de Lima - Depto. de Bioquímica – UFRN Henrique César de Jesus Ferreira - Depto. de Biologia Molecular e Genética – UFRN Roberta Luciana do Nascimento Godone - Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – UFPE Paula Simone Ortiz Barros - Depto. de Biologia Celular e Genética – UFRN Luciana Duarte Martins da Matta - Profa. Dra. – Depto de Bioquímica - UFRN

INTRODUÇÃO:

As N-acetil-β-D-glucosaminidades (NAGs) são quitinases envolvidas na degradação da quitina e pertencem a um grupo de enzimas que hidrolisam componentes O-glicosídicos, removendo resíduos terminais não-redutores de N-acetil-β-D-glucosamina, sendo assim, considerada uma exoglicosidase (HORSCH et al., 1997). Dentre os decápodas, o hepatopâncreas é particularmente bem desenvolvido ocupando a maior parte da cavidade cefalotorácica e tem como função principal a secreção de enzimas e emulsificantes (GIBSON & BARKER, 1979; VONK, 1960; BLANDAMER & BEECHEY, 1964; VAN WEEL, 1970). Existem poucos estudos sobre as enzimas produzidas por este órgão na lagosta Panulirus argus, por isto, neste trabalho, foram identificadas e purificadas parcialmente as enzimas N-acetil-β-D-glucosaminidades e N-acetil-β-D-galactosaminidades extraídas deste organismo marinho, que é de grande importância econômica para o nosso Estado.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este trabalho teve como objetivos a extração e fracionamento de quitinases obtidas a partir do hepatopâncreas de lagostas Panulirus argus. Identificação destas, utilizando-se substratos sintéticos em diferentes temperaturas. Purificação parcial das N-acetil-β-D-glucosaminidades e N-acetil-β-D-galactosaminidades presentes na FI. E caracterização cinética da quitinase selecionada.

MÉTODOS:

Os hepatopâncreas foram retirados, homogeneizados com tampão acetato de sódio 0,1M pH 5,0 e centrifugados, sendo os extratos brutos fracionados em três etapas com sulfato de amônio: 0-30%(FI), 30-50%(FII) e 50-80%(FIII). Após diálise estas frações foram ensaiadas com substratos sintéticos nas temperaturas de 37,45 e 55°C. A fração FI foi submetida à Cromatografia de troca iônica DEAE-Celulose onde as proteínas foram eluídas com tampão fosfato de sódio 0,2M pH 8,0 acrescido de cloreto de sódio nas concentrações de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0M. O pool reunido a partir da concentração de 0,2M de NaCl foi submetido à Cromatografia de Gel-Filtração S-200, nesta as proteínas foram eluídas com tampão acetato de sódio 0,1M pH 5,0. E o perfil de eluição proteica de ambas as cromatografias foi determinado por absorbância a 280nm. Os experimentos cinéticos de temperatura ótima, estabilidade frente à temperatura, pH ótimo e estabilidade frente ao pH foram realizados incubando-se alíquotas da enzimas e do substrato em diferentes condições.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Os resultados mostraram a presença de quase todas as atividades enzimáticas nas frações pesquisadas, nas temperaturas de 37º, 45º e 55ºC. Fato este já observado nos extratos de Aplysia cervina (MATTA; ABREU, 2005) e no camarão Litopenaeus schmitti (GODONE, 2008). A N-acetil-β-D-glucosaminidase (NAG) e a N-acetil-β-D-galactosaminidase ambas apresentaram maior atividade específica na F-I, na temperatura de 55ºC. No equinodermo Echinometra lucunter (LIMA, 2006) e Litopenaeus schmitti (GODONE, 2008) a NAG também foi uma das enzimas que apresentaram maior atividade específica nas frações extraídas. A atividade ótima observada foi de 50ºC. Estudos cinéticos realizados por GODONE, 2008 utilizando uma NAG extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schimitt mostraram temperatura ótima em torno de 55°C, assim como os estudos de FERREIRA (2010). A estabilidade frente às temperaturas foi observada entre 25 a 60°C. O mesmo foi observado por GODONE, 2008 e FERREIRA (2010) observou uma estabilidade entre 45 a 55°C. O pH ótimo foi de 5,0, corroborando com os estudos de FERREIRA (2010) e GODONE (2008). Uma NAG purificada da semente de ervilha (KIMURA et al., 1996) mostrou estabilidade em pH que variava de 4,0 a 7,0. A estabilidade da enzima é atingida numa faixa de pH entre 5,0 e 6,0.

CONCLUSÕES:

O hepatopâncreas da lagosta Panulirus argus apresentou-se como excelente fonte de extração de enzimas com atividade quitinolítica. A enzima apresentou atividade ótima na temperatura de 55 ºC, apresentando estabilidade térmica entre 25 e 60 ºC, o que lhe confere uma característica termoestável, podendo servir como ótima ferramenta biotecnológica, uma vez que suporta altas temperaturas sem sofrer grandes mudanças conformacionais. Com relação ao pH a enzima apresentou ótima atuação em uma faixa de pH levemente ácido e boa estabilidade em pHs levemente ácidos e neutro, podendo ser utilizada com diferentes tampões que compreendem a esta faixa. Conhecendo algumas características da quitinase, outros testes podem ser feitos a fim de caracterizá-la melhor, mas os resultados obtidos indicam que esta enzima pode servir como uma excelente ferramenta na elucidação de estrutura química de glicoconjugados, na produção de oligossacarídeos de quitina, através de sua hidrólise, gerando produtos de ampla aplicação em diversas áreas, como farmacêutica, alimentícia, agricultura, dentre outras. A enzima ainda pode servir como ferramenta biotecnológica fungicida, bactericida e inseticida natural.

Palavras-chave: Purificação, N-acetil-β-D-glucosaminidase, Panulirus argus.