65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

COMPARAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL E DETECÇÃO POR IMUNOFLUORESCÊNCIA EM IMPRINT DE TECIDO RENAL COMO MÉTODOS DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE LEPTOSPIRAS EM AMOSTRAS EXPERIMENTAIS.

ADENIZAR DELGADO DAS CHAGAS JUNIOR - Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA CAROLINE LUANE RABELO DA SILVA - Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA DANIEL ABENSUR ATHANAZIO - Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA MITERMAYER GALVÃO DOS REIS - Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA FLÁVIA WEYKAMP DA CRUZ MCBRIDE - Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA ALAN JOHN ALEXANDER MCBRIDE - Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA

INTRODUÇÃO:

A leptospirose é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Estas bactérias colonizam os túbulos renais de diferentes hospedeiros como cães, ratos, bovinos, entre outros. Atualmente, a técnica empregada nas análises qualitativas e quantitativas de Leptospira em diferentes tecidos é a cultura e o PCR em tempo-real (qPCR). Entretanto, existe a necessidade do desenvolvimento de uma técnica alternativa que apresente menores custos e a mesma eficiência.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Comparar o PCR em tempo real e imunofluorescência em imprint de tecido renal como métodos de detecção e quantificação de leptospiras em tecidos.

MÉTODOS:

Nos experimentos foram usados 38 animais, sendo 11 hamsters, 15 camundongos da linhagem A e 12 ratos da linhagem Wistar. Estes animais foram infectados com L. interrogans via intraperitoneal com as doses de 500, 106 e 108, respectivamente. O gene lipL32, altamente conservado em leptospiras patogênicas, foi usado como alvo nas amplificações. O qPCR foi realizado com o equipamento da Applied Bioscience 7500 Thermo cycler: 50°C por dois minutos (1 ciclo), 95°C por dez minutos (1 ciclo), 95°C por quinze segundos (40 ciclos) e 60°C por 60 segundos. Cada reação possui um volume final de 25 μL: 10 μL de Taqman mastermix, 1 μL de sonda (250 μM), 1 μL de cada primer (10 mM), 8 μL de água e 4 μL da amostra de DNA total (80 ng). As amostras de DNA total foram extraídas de 25 mg de tecido renal, sendo quantificado e ajustado para 20 ng/uL. A técnica do imprint, previamente descrita por nosso grupo, foi utilizada para quantificar as leptospiras no tecido renal (contagem feita em 10 campos de 1000x). Para realizar as análises do qPCR foi desenvolvida uma curva padrão usando DNA de L. interrogans extraído de cultura.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Todos os hamsters foram necropsiados com oito dias pós-infecção (PI) e apresentaram colonização renal positiva e foram quantificados (média ± DP leptospiras), no imprint (138 ± 98), no qPCR (média 22.037 ± 16.083), sendo todos positivos na cultura. Os ratos foram necropsiados com 28 dias PI. Dois dos ratos positivos na cultura e no imprint foram negativos no qPCR, (Tabela 1). Os ratos positivos apresentaram uma menor carga de leptospiras no imprint renal (09 ± 11) e também no qPCR (163 ± 260). Na análise global das amostras renais foi encontrada uma correlação positiva entre o imprint e o qPCR (P = 0.001, r = 0.8). Avaliando individualmente, foi encontrada correlação positiva em todos os grupos: hamster (P = 0.02, r = 0.65) e rato (P = 0.01, r = 0.7). Neste estudo nós demonstramos através da técnica do imprint uma forma rápida para quantificar leptospiras no tecido renal. A técnica do imprint apresentou uma forte concordância quando comparada com a técnica de qPCR, que é utilizada atualmente como ferramenta para quantificação absoluta de leptospiras em diferentes amostras de tecidos.

CONCLUSÕES:

Podemos concluir que a técnica de imprint por apresentar um custo mais baixo e maior rapidez nos resultados, pode ser utilizada como uma ferramenta de grande utilidade na quantificação relativa de leptospiras.

Palavras-chave: leptospirose, imprint, pcr em tempo real.