65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

ISOLAMENTO E AVALIAÇÃO BIOINSETICIDA DE UMA QUITINASE EXTRAÍDA DO CEFALOTÓRAX DE CAMARÃO Litopenaeus schmitti

Bruna Maria Braga Figueiredo - Depto. de Bioquímica - UFRN Roberta Luciana do Nascimento Godone - Depto. de Bioquímica - UFRN Juliana Gabriela Silva de Lima - Depto. de Bioquímica - UFRN Luiz Roberto Diz de Abreu - Prof. Dr. - Depto. de Bioquímica - UFRN Luciana Duarte Martins da Matta - Profa. Dra./Orientadora - Depto. de Bioquímica - UFRN

INTRODUÇÃO:

O camarão branco Litopenaeus schmitti, é o único pertencente ao gênero Litopenaeus que ocorre em águas brasileiras (MAGGIONI et al., 2003). O cefalotórax desses animais apresentam as enzimas quitinases que clivam ligações glicosídicas entre os carbonos C1 e C4 dos resíduos de β-1,4-N-acetilglucosamina (GlcNAc), constituintes do polímero de quitina. Estas enzimas são classificadas como glicosil hidrolases, e compreendem cerca de 90 famílias de enzimas descritas (HORSCH et al., 1997; SEIDEL., 2008).

OBJETIVO DO TRABALHO:

O presente trabalho objetiva testar o efeito larvicida sobre Aedes aegypti do extrato bruto e frações protéicas obtidas do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti com atividade quitinolítica.

MÉTODOS:

O cefalotórax dos camarões Litopenaeus schmitti foram removidos e homogeneizados em tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0. A solução foi centrifugada (12.000 x g a 4ºC) e a fase solúvel foi utilizada para fracionamento com sulfato de amônio em três etapas de saturação 0-30%, 30-50% e 50-80%. Em cada etapa foi realizada centrifugação, os precipitados foram ressuspensos em tampão acetato de sódio e dialisados. Estas frações foram denominadas F-I, F-II e F-III, respectivamente. A fração F-III foi submetida à cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel onde a enzima foi eluída com tampão fosfato de sódio acrescido de NaCl em diferentes concentrações. A fração eluída a 0,2M de NaCl foi aplicada em cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200, com tampão acetato de sódio. As proteínas foram eluídas utilizando-se o mesmo tampão. Os perfis de eluição protéica foram monitorados em espectrofotômetro a 280 nm e para a determinação das atividades enzimáticas. Para a atividade larvicida foi utilizanda uma adaptação do método da Organização Mundial de Saúde (1981). Cinco larvas (L4) foram colocadas em recipientes contendo os extratos brutos, F-III e Litochitinase1. Foram utilizadas três concentrações diferentes para cada solução, com volume final do ensaio 20 mL para os testes e controle negativo. Os ensaios foram realizados em quadruplicatas e a taxa de mortalidade das larvas foi determinada após 24 e 48 h de incubação a 28 ± 2 ° C com fotoperíodo de 12/12 h (claro-escuro).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Neste trabalho a Litochitinase1 foi purificada 987,32 vezes utilizando-se cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e de exclusão molecular Sephacryl S-200 apresentando massa molecular em torno de 28,5 kDa. Após testes cinéticos a Litochitinase1, mostrou atividade ótima em pH variando de 5,0 a 6,0, temperatura ótima a 55°C. A enzima apresentou uma faixa de estabilidade nos pHs de 4,0 a 5,5. Testes antimicrobianos realizados mostraram que a Litochitinase1 apresenta atividade contra a bactéria gram-negativa E. coli. A atividade larvicida contra Aedes aegypti foi investigada com os extratos brutos, F-III e a Litochitinase1 com tempo de 24 e 48 horas. Os resultados obtidos mostraram atividade larvicida em todas estas amostras com valores de LC50 de 6,59 mg/mL para o extrato bruto, 5,36 mg/mL para F-III e 0,79 mg/mL para Litochitinase1 com 24 horas de ensaio e 3,22 e 0,71 mg/mL, para F-III e Litochitinase1 no tempo de 48 horas.

CONCLUSÕES:

Pôde-se observar a presença de atividades glicosidásicas e sulfatásicas nos extratos enzimáticos obtidos do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti. Observou-se também que a fração F-III (50-80%) apresentou maior atividade quitinolítica. A Litochitinase1 foi purificada na ordem de 987,32 vezes e com recuperação de 2,62% apresentando massa molecular de aproximadamente 28,5 kDa. A Litochitinase1 apresentou atividade larvicida contra larvas de Aedes aegypti de maneira dose dependente e, de acordo com os outros resultados obtidos como: ausência de proteínas contaminantes como inibidores de proteinases serínicas e lectinas, esta atividade se confirma indicando-a para ser usada como alternativa de controle eficaz na redução da infestação pelo mosquito vetor.

Palavras-chave: Quitinase, Litopenaeus schmitti, Atividade larvicida.