65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 5. Biofísica

ASSOCIAÇÃO DE CONCANAVALINA A E BICAMADA LIPÍDICA AUTOMONTADA PARA O DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR PIEZOELÉTRICO PARA O DIAGNÓSTICO DA DENGUE

Débora Máximo das Neves Luna - Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica - UFPE Maria Danielly Lima de Oliveira - Depto. de Bioquímica - UFPE Maurício Lacerda Nogueira - Depto.de Doenças Infecciosas e Parasitária - FAMERP César Augusto Souza de Andrade - Prof. Dr./ Orientador- Depto. de Bioquímica - UFPE

INTRODUÇÃO:

A infecção pelo vírus da dengue (DENV) é considerada um problema de saúde pública mundial. Os quatro sorotipos existentes do vírus (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) podem manifestar desde um quadro febril ao quadro de choque hipovolêmico, o qual pode ser fatal. No Brasil, ocorreram quatro epidemias nos últimos 20 anos e todas relacionadas à mudança no sorotipo predominante. Sabe-se que infecções secundárias provocadas por sorotipo distinto da infecção inicial, apresentam maior risco de severidade. Desta forma, é de extrema importância o diagnóstico precoce da infecção para que sejam tomadas medidas eficazes de vigilância e controle, já que atualmente não existem vacina e tratamento específico disponíveis. Em infecções por dengue, mesmo em estágios iniciais, evidencia-se aumento na expressão de glicoproteínas no soro. Por outro lado, lectinas, tais como Concanavalina A, tem sido utilizada no biorreconhecimento de resíduos de carboidratos. Além disso, a microbalança de cristal de quartzo (QCM) tem sido utilizada para o desenvolvimento de biossensores piezelétricos devido a alta sensibilidade, facilidade operacional, simplicidade e resposta em tempo real, sendo uma alternativa eficaz na identificação precoce da doença.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Desenvolver um biossensor piezoelétrico constituído por membrana lipídica e possuindo como camada de reconhecimento a lectina Concanavalin A para a detecção de glicoproteínas presentes no soro de pacientes contaminados com dengue I, II e III.

MÉTODOS:

A superfície do cristal de quartzo com ouro (5 MHz) foi modificada com uma solução etanólica de 3-mercaptopropiltrimetoxisilano (0,1 mM) por 30min, lavado com etanol e incubado por 1h a 40°C. Posteriormente, 25 µl de vesículas lipídicas (lipossomas) foram depositadas na superfície por incubação a 60 min. Lipossomas foram obtidos por evaporação do filme lipídico, a partir de uma solução de DPPC (1mg/ml) em clorofórmio, seguida por hidratação do filme em 10 ml de PBS (0,2 M, pH 7.4). As medidas foram realizadas em sistema de injeção de fluxo (210 µ/min). Primeiramente foi realizado o estudo otimização da camada de lectina depositada sobre o cristal. Para isso, 500 µl de uma solução 2,7 µM de Con A em PBS (7,4) foram injetados de maneira seqüencial. As medidas foram realizadas por adições sucessivas de 300 µl do soro numa diluição de 1:40 do soro dos pacientes contaminados com dengue.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Para determinação da concentração da lectina a ser utilizada neste estudo utilizamos Con A na faixa de 2.7 a 21.6 µM e foi observado que a saturação ocorreu em 16.6 µM (Δf=246.1 Hz). Em adição, após esta concentração houve uma redução da Δf devido à desestruturação do filme de lipídio e lectina. A constante de afinidade obtida foi 2.79 X 106M-1. Após exposição do sistema sensor aos sorotipos DENV1, DENV2 e DENV3, observou-se variações significativas na frequência de ressonância. As respostas de foram Δf foram lineares com o aumento da concentração dos sorotipos. O sistema sensor apresentou maior afinidade pelo sorotipo DENV-I (Δfmax=277 Hz), seguido pelo DENV-II (Δfmax=267 Hz) e DENV-III (Δfmax=260 Hz).

CONCLUSÕES:

Foi obtido um biossensor baseado em membrana lipídica e Concanavalina A para a detecção de glicoproteínas do soro de pacientes contaminados com dengue utilizando a técnica da QCM. Além disso, foi possível obter um padrão específico na resposta piezoelétrica dos sorotipos da Dengue devido às diferenças no perfil de glicoproteínas anormais presentes no soro infectando pelo vírus. O biossensor proposto neste trabalho representa um novo método na detecção de glicoproteínas no soro de pacientes contaminados com dengue, sendo uma possível alternativa às técnicas mais sofisticadas com vantagem operacional e resposta em tempo real para a identificação dos sorotipos existentes.

Palavras-chave: Microbalança de cristal de quartzo, Lectina, Vírus da dengue.