66ª Reunião Anual da SBPC

Resumo aceito para apresentação na 66ª Reunião Anual da SBPC pela(o): SBPC - SOCIEDADE BRASILEIRA PARA O PROGRESSO DA CIÊNCIA

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 1. Microbiologia

Tratamento com tungstênio reduz colonização intestinal de camundongos por Escherichia coli através do bloqueio da respiração anaeróbica.

Everton de Lima Romão - Escola de Veterinária - UFMG Sebastian Winter - University of California - Davis Maria Winter - University of California - Davis Andreas Baumler - University of California - Davis Renato de Lima Santos - Orientador / Escola de Veterinária - UFMG

INTRODUÇÃO:

O molibdênio e o tungstênio são metais que atuam no metabolismo celular como cofatores enzimáticos. O molibdênio é um cofator essencial para atuação de algumas enzimas que possibilitam bactérias como a Escherichia coli (E. coli) realizarem respiração anaeróbica em situações de baixa disponibilidade de oxigênio. Foi comprovado que esta característica favorece sua colonização e sobrevivência intestinal oportunista quando há inflamação, como observado em pacientes com doenças intestinais crônicas como a doença de Crohn. Nestas situações a proliferação destas bactérias resulta em um desiquilíbrio da microbiota e agravamento dos casos. O mutante de E. coli incapaz de produzir o cofator de molibdênio (MoCo) coloniza menos o ceco e cólon de camundongos com inflamação intestinal quando comparada a cepa selvagem, pois é incapaz de realizar respiração anaeróbica. Sabe-se que o tungstênio é capaz substituir o molibdênio impedindo a ação de algumas enzimas. Com isso, o tratamento destes camundongos com tungstênio poderia inativar o cofator de molibdênio, mimetizando o que foi demonstrado através de deleção genética, impedindo a realização da respiração anaeróbica e reduzindo a habilidade de colonização destas bactérias.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O objetivo deste trabalho é demonstrar que o tungstênio é capaz de inibir a ação do cofator de molibdênio em bactérias como a Escherichia coli, impedindo a realização da respiração anaeróbica, e assim, reduzindo sua vantagem em relação à microbiota em situações de inflamação intestinal.

MÉTODOS:

No ensaio enzimático da atividade de redução do nitrato culturas de E. coli selvagens e mutantes incapazes de utilizar o nitrato (NR) na respiração anaeróbica foram expandidas em caldo LB por 16 horas e diluídas 1:50 em novo caldo LB contendo 40 mM de nitrato de sódio e diferentes concentrações de tungstato de sódio (Na2WO4), sendo de 10 ug/mL, 1 ug/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL e água nas culturas de E. coli selvagem e 10 ug/mL e água nas culturas de NR E. coli. Foram incubadas a 37o C em tubos fechados por 3 horas e a produção de nitrito foi mensurada conforme descrito por Stwart e Parales (1988). No teste in vivo , foi induzida colite em camundongos pela administração de solução de dextrano sulfato de sódio (DSS) a 3% em água. Os animais foram divididos em dois grupos, um recebeu, além do DSS, tratamento com 0,2% de tungstato de sódio na água. Quatro dias depois, foi feita a inoculação intra-gástrica com 0,1 mL de caldo LB com quantidades iguais (5x108 UFC cada) das cepas selvagem e mutante MoCo E. coli. Após cinco dias, foi realizado o sacrifício dos animais e coleta de conteúdo do cólon e ceco. Foi feita a diluição seriada na base de 10 e plaqueamento em ágar seletivo para contagem.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

No teste enzimático foi possível observar que o tungstênio inibiu a utilização do nitrato pelas bactérias, mostrando menor produção de nitrito, sendo que quanto maior a concentração de tungstato de sódio, menor a produção de nitrito. O resultado deste ensaio enzimático é obtido através de fórmula matemática que considera a contagem bacteriana total da cultura e normaliza os dados para uma contagem bacteriana comum, reduzindo os efeitos do crescimento desigual das bactérias. A inibição foi mais eficiente quando a concentração estava acima de 10 ng/ml. A partir destes resultados, foi observado que o tungstênio possui capacidade inibitória da utilização do nitrato em condições de anaerobiose in vitro, por isso decidimos realizar o teste em camundongos. Neste experimento foi utilizado a cepa mutante MoCo E. coli, sabidamente incapaz de realizar respiração anaeróbica, em co-infecção com a cepa selvagem, com e sem tratamento com tungstênio em camundongos com colite por DSS. Nos animais não tratados com tungstênio a cepa selvagem cresceu significativamente mais que a mutante, como já era esperado. Porém, no grupo tratado com tungstênio não houve diferença significativa de crescimento entre as duas cepas. Estes dados nos indicam que o tratamento com tungstênio, retirou a vantagem que a cepa selvagem possuía. A colonização e proliferação entre as cepas foram igualadas, possivelmente pelo bloqueio da respiração anaeróbica na cepa selvagem, mimetizando a deleção genética existente na mutante MoCo E. coli. Estes resultados mostram o grande potencial do tratamento com o tungstênio como alternativa para atuação direta em microrganismos oportunistas que usam dos aceptores de elétrons presentes em situações de inflamação intestinal para proliferar, em depressão da microbiota normal.

CONCLUSÕES:

Inflamações intestinais crônicas como colite ulcerativa e doença de Crohn são doenças que acometem humanos e animais. São acompanhadas de uma alteração no equilíbrio microbiano intestinal, conhecido como “disbiose”, com proliferação de bactérias oportunistas que utilizam aceptores de elétrons, disponíveis neste ambiente, para realizar respiração anaeróbica e se sobrepor aos outros microrganismos fermentativos. O cofator de molibdênio é essencial para este processo. Entretanto, o tungstênio é capaz de bloquear este cofator, e ele se mostrou eficiente tanto in vitro quanto na administração em camundongos, retirando a vantagem que a respiração anaeróbica concedia a cepas de E. coli. Com isso o tratamento com tungstênio se mostra promissor em pacientes com doenças intestinais crônicas, que já apresentam desiquilíbrios na homeostasia intestinal, pois pode agir especificamente em bactérias que proliferaram oportunistamente graças a respiração anaeróbica.

Palavras-chave: Colite crônica, Molibdênio, Tungstênio.