66ª Reunião Anual da SBPC

Resumo aceito para apresentação na 66ª Reunião Anual da SBPC pela(o): SBTx - Sociedade Brasileira de Toxinologia

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Bioquímica

EFEITO MICROBICIDA DE L-AMINOÁCIDO OXIDASE ISOLADA DO VENENO DE Crotalus atrox

Mauro Valentino Paloschi - CEBio/FIOCRUZ - Porto Velho, RO. Rafaela Diniz Sousa - CEBio/FIOCRUZ - Porto Velho, RO. Diana da Silva Butzke - CEBio/FIOCRUZ - Porto Velho, RO. Raíres Ferreira Rodrigues - CEBio/FIOCRUZ - Porto Velho, RO. Antonio Coutinho Neto - Orientador - CEBio/FIOCRUZ - Porto Velho, RO.

INTRODUÇÃO:

O Brasil possui diversas espécies de serpentes peçonhentas, das quais se destacam os gêneros Bothrops e Crotalus, considerados os principais responsáveis pelos casos de acidentes ofídicos do país (BRASIL, 2009). O veneno de Crotalus é constituído principalmente por proteínas e peptídeos, como L-aminoácido oxidase (LAAO), convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina (MARTINS et al., 2002). As LAAOs são flavoenzimas responsáveis pela desaminação oxidativa de um L-aminoácido a um α-cetoácido, produzindo amônia e peróxido de hidrogênio na reação (DU; CLEMETSON, 2002; PAWELEK et al., 2000). Estudos com LAAO de serpentes mostram diversas ações biológicas, como indução a apoptose, citotoxicidade, agregação plaquetária, hemorragia e hemólise (ZULIANI et al., 2009), além de demonstrarem propriedades bactericida, contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (LEE et al., 2011; TOYAMA et al., 2006), antiviral, contra o vírus HIV (ZHANG et al., 2003), e antiparasitária, contra Leishmania amazonensis e Leishmania chagasi (COSTA TORRES et al., 2010). O amplo espectro biológico da LAAO e seu mecanismo de ação são ferramentas em potencial para estudos científicos que visem à descoberta de novas drogas microbicidas.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Isolar e caracterizar bioquimicamente a enzima L-aminoácido oxidase do veneno de Crotalus atrox e avaliar sua ação antimicrobiana contra bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli.

MÉTODOS:

O isolamento da LAAO foi realizado em três etapas cromatográficas em Sistema de Cromatografia de Alta Eficiência (HPLC), como descrito por Toyama e colaboradores (2006). A primeira etapa realizou-se numa coluna de exclusão molecular (Superdex 75, 1x60 cm), onde as frações obtidas foram analisadas em Eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% (SDS-PAGE) (LAEMMLI, 1970) e pela atividade enzimática de LAAO (KISHIMOTO; TAKAHASHI, 2001). Na segunda etapa, a fração ativa para LAAO foi recromatografada em coluna de troca iônica (DEAE-Sepharose, 1x30 cm), sendo os picos avaliados quanto a massa molecular (SDS-PAGE) e atividade enzimática. Para confirmação da pureza foi realizada uma terceira etapa cromatográfica em coluna de fase reversa (C18 Discovery 25x4,6 cm). Para a caracterização bioquímica do veneno bruto realizou-se as atividades coagulante (THEAKSTON; REID, 1983), LAAO (KISHIMOTO; TAKAHASHI, 2001) e fosfolipásica (HOLZER; MACKESSY, 1996). A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi determinada pelo teste de suscetibilidade de microdiluição (VARGAS et al., 2012) com as bactérias Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus aureus (ATCC 29213), onde a inibição do crescimento bacteriano foi avaliada pela CIM de LAAO ou veneno bruto em espectrofotometria (630 nm).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Na primeira etapa cromatográfica obteve-se 08 frações. Após 1D SDS-PAGE e atividade enzimática, observou-se que a fração 2 continha uma banda de 46 a 56 kDa e apresentava atividade de LAAO. A massa obtida condiz com estudos realizados com LAAO de serpentes cuja massa em condições reduzidas é de 55 a 66 kDa (ALI et al., 2000). A partir dessa fração foi realizada uma segunda etapa cromatográfica, no qual foram eluidos 10 picos. Uma proteína com massa molecular semelhante a LAAO foi identificada na fração 9. Conforme o método de dosagem de proteínas totais de Bradford (1976), o veneno de C. atrox apresentou cerca de 0,870 mg/mL de proteínas totais. A atividade coagulante com o veneno bruto de C. atrox apresentou baixa potencialidade, pois com uma dosagem de 40 µg do veneno o plasma coagulou somente em 3 minutos, o que confere com os dados descritos por Theakston e Reid (1983). As amostras de LAAO de Crotalus adamanteus mostraram atividade coagulante em menor concentração de veneno em relação às obtidas com o veneno bruto e a LAAO de C. atrox, pois a LAAO de C. atrox coagulou o plasma com 38 µg em 1 min e a LAAO de C. adamanteus coagulou com 8 µg em 1 min. Para o teste de LAAO, o veneno bruto apresentou uma reação de 0,164 U/min; essa atividade foi inferior ao veneno de Crotalus durissus cascavella de 1,059 U/min. Para a atividade fosfolipásica, o veneno de C. atrox apresentou uma atividade de 28,35 U/min, em comparação ao veneno de Bothrops urutu de 59,20 U/min. Serpentes pertencentes ao gênero Bothrops são extremamente miotóxicos, o que justifica sua alta atividade fosfolipásica. A atividade bactericida realizada com o veneno bruto e LAAO isolada apresentou uma CIM de 120 µg/µL para S. aureus. Para E. coli somente a LAAO isolada apresentou atividade antimicrobiana com uma CIM de 200 µg/µL.

CONCLUSÕES:

A L-aminoácido oxidase do veneno de Crotalus atrox foi purificada em três etapas cromatográficas. O veneno bruto apresentou um percentual de 87% de proteínas totais em relação a 1mg/mL. O veneno bruto possui atividade de LAAO inferior ao de outras espécies de Crotalus. A LAAO isolada e o veneno bruto mostraram um baixo potencial de coagulação. Observou-se que a LAAO de C. atrox é sensível aos procedimentos de processamento de amostra devido as variações de temperatura e pH que são aplicadas para a purificação de proteínas. Quanto à atividade bactericida, as concentrações de LAAO e do veneno bruto testados obtiveram significância quanto a inibição do crescimento bacteriano para S. aureus, e para E. coli somente a LAAO teve atividade.

Palavras-chave: Crotalus atrox, L-aminoácido oxidase, Atividade microbicida.