Reunião Regional da SBPC no Recôncavo da Bahia

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 3. Microbiologia

CONFIRMAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS DO GÊNERO Bacillus POR MEIO DE PCR

Yslai Silva Peixouto 1 Eliane Santos Jesus 2 Eliana Maria Rocha Sousa 3 Emanuelle Burgos Cardoso 4 Augusto Moura da Silva 5 Jorge Teodoro de Souza 6

1. Graduanda em Ciências Biológicas - UFRB 2. Graduanda em Ciências Biológicas - UFRB 3. Graduanda em Ciências Biológicas - UFRB 4. Graduanda em Ciências Biológicas - UFRB 5. Dotourando em Ciências Agrárias - UFRB 6. Prof. Dr. - Departamento de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas - UFRB

INTRODUÇÃO:

O Brasil é o maior produtor de sisal ( Agave sisalana ) do mundo, com produção anual da fibra de cerca de 140.000 toneladas. Contudo, a doença podridão vermelha do caule de sisal é um dos principais problemas fitossanitários dessa cultura, causada pelo fungo Aspergillus niger . O uso de microrganismos antagonistas ao fitopatógeno torna-se uma das alternativas viáveis para o controle da doença. Dentre os antagonistas, Bacillus spp. destacam-se como bons agentes de biocontrole. Essas bactérias são aeróbicas ou anaeróbicas facultativas, gram-positivas em forma de bastonete, produzem endósporos e são amplamente distribuídas no ambiente. A identificação dos isolados é uma etapa fundamental no processo de seleção. Nesse sentido, o método de amplificação de ácidos nucléicos conhecido como PCR ( Polymerase Chain Reaction ) tornou-se uma das mais importantes ferramentas de detecção de microrganismos. Assim, o objetivo deste estudo foi conhecer a população de Bacillus spp. associada ao sisal e sua relação com plantas sintomáticas e assintomáticas.

METODOLOGIA:

Amostras de plantas de sisal assintomáticas e com sintomas de podridão vermelha, foram coletadas e submetidas a diluição seriada (101 a 105). Semeadas em placa de Petri em triplicata contendo meio semi-seletivo para Bacillus spp. e incubadas a 25ºC. As colônias foram transferidas para microtubos contendo 100µl de solução tampão (SDS 25% + NaOH 0,05M) para extração de DNA. O microtubulo foi fervido por 15’, e depois centrifugado por 1’ a 10.000 rpm. O sobrenadante foi coletado e diluido em água estéril 20x. Amostras de DNA foram amplificadas via PCR utilizando um par de primers específico para o gênero Bacillus (B-K1/F e B-K1/R). com 1114-pb. As reações foram feitas com volume total de 25 µl em termociclador PTC-100, com o seguinte programa: 94 ºC por 3’; seguidos de 25 ciclos de 94 ºC por 30’’, 63 ºC por 30’’, 72 °C por 2’; e extensão final de 72 ºC por 10’. Após a amplificação realizou-se eletroforese em gel de agarose 1,5%, e fotodocumentação.

RESULTADOS:

Foram testadas 161 amostras de DNA de isolados oriundos da quantificação de órgãos de plantas sadias e doentes de sisal, e solo. Sendo que 109 isolados amplificaram os fragmentos do gene correspondente ao gênero Bacillus spp. Constatou-se que o maior número de isolados de Bacillus spp. foi obtido de amostras provenientes em solo de plantas sadias (96,55%) e em raiz de plantas sadias (92%). De modo geral foi observada maior quantidade de amplificações em órgãos de plantas sadias. Os isolados de Bacillus spp. encontrados em folha doente (16,66 %) foi menor que em folha sadia (66,66%). O mesmo foi observado em caule doente (0%) e sadio (84,78%); raiz doente (0%) e sadia (92%); e solo de plantas doentes (64%) e sadias (96,55%).

CONCLUSÃO:

O gene utilizado para amplificação de bactérias do gênero Bacillus é eficiente. O PCR é uma ferramenta viável para a confirmação molecular de isolados de Bacillus spp., sendo observada maior quantidade de amplificações em solo e órgãos de plantas sadias. Os isolados que não amplificaram deverão passar por uma nova analise, para verificar se a ausência de amplificação é devida a não pertencerem ao gênero Bacillus ou a possível degradação do DNA.

Palavras-chave: Bacillus spp, PCR, controle biológico.